مقاله رایگان درمورد دماي، تصوير، ايزوله، pcr

دانلود پایان نامه

آن‌‌ها، اختلاف پتانسيل و شدت جريان‌هاي مختلف، منابع تغذيه ولتاژ تانك‌هاي مختلف الكتروفورز و تانك‌هاي مختلف الكتروفروز و هم چنين زمان‌هاي مختلف الكتروفورز مورد ارزيابي و بررسي قرار گرفتند، كه بهترين حالت با ژل آگاروز با غلظت 5/1 درصد حل شده در بافر TBE (5X) و بافر تانك TBE(1X)، اختلاف پتانسيل 80 ولت و به مدت 1 ساعت با دستگاه الكتروفورز شركتBio Rad حاصل آمد.

3-7-مواد مورد نياز براي انجام الکتروفورز
3-7-1-ژل آگارز
3-7-1-1-طرز تهية ژل آگاروز
درصد ژل مورد استفاده در اين تحقيق 5/1 درصد بوده با توجه به درصد ژل، ميزان پودر آگاروز را محاسبه نموده و پس از وزن كردن، پودر را بسته به نوع تانك (بزرگ و يا كوچك بودن) با ميزان مناسب از بافر TBE(1X) در داخل بشر مخلوط کرده و بر حسب نوع استفاده با درصد خاص 5/1 به ترتيب به ميزان 5/1گرم از پودر آگاروز با 100سي‌سي بافر(1X) TBE مخلوط گرديده و پس از مخلوط كردن پودر آگاروز در بافر TBE1 X، آن را در مايكروويو قرار داده و پس از شفاف شدن محلول و رسيدن دماي آن به 50-45 درجه سانتيگراد سپس شانه را در داخل آن قرار داده، بايد به دقت به داخل قالب ريخته ‌شود و تا سرد شدن كامل ژل صبر نموده تا زماني كه ژل حالت شيري رنگي را پيدا نمايد.

3-7-1-2-تهيه بافر الكتروفورز
* محلول EDTA
* Buric acid
* Tris base (TBE-5X)
محلول ذخيره 5 بار غليظ TBE(5X) به صورت زير تهيه و در زمان مصرف با آب مقطر رقيق شد. ابتدا 7/3 گرم EDTA را به همراه54 گرم از تريس بيس و 5/ 27 گرم از بوريك اسيد را وزن کرده و با آب مقطر به حجم 900 ميلي ليتر مي‌رسانيم. pH آن را روي 8 تنظيم نموده و به حجم 1000 ميلي ليتر رسانديم.
3-7-1-3-بافر سنگين کننده (10x Sample bading Buffer)
اين بافر سنگين کننده محلول است تا از درون چاهک ژل خارج نشود و از طرفي مي‌توان محل محصولات PCR را بوسيله رنگ بروم فنل بلو که در جلو حرکت مي‌کند را مشاهده کرد. 6 ميکروليتر از محصول PCR را با 5/1 ميکروليتر لودينگ بافر مخلوط کرده و به آرامي توسط سمپلر درون چاهک ژل تخليه گرديد.
ماركرمولکلي(DNA Lader )مورد استفاده
ماركر مورد استفاده در اين تحقيق 1000 DNA Lader bp ساخت شركت Viogene با فاصله 100 جفت باز از وزن 100 وزن 3000 جفت باز بود كه براي مشخص كردن طيف گسترده‌اي از باندها با اندازه‌هاي مختلف وزن مولكولي تعبيه شده است.
3-7-1-4-رنگ آميزي ژل:
رنگ مورد استفاده در اين تحقيق اتيديوم برومايد تهيه شده از شركت سيناژن بود. مقدار 30 ميكروليتر از رنگ با 300 سي‌سي آب مقطر دو بار تقطير مخلوط هم زده و ژل الكتروفورز به مدت 20 دقيقه در آن قرار داده تا مراحل رنگ آميزي انجام شود. رنگ اتيديوم برومايد سرطانزا بوده و از ريختن آن دركف آزمايشگاه و يا تماس با پوست جداً خودداري گردد. و سپس شستشوي ژل در آب مقطر و سرانجام در دستگاه Gel documentation عمل عكسبرداري از ژل و ذخيره اطلاعات انجام مي‌گرديد.
اين رنگ ساخته شده براي رنگ‌آميزي ژل‌هاي متعددي مي‌تواند مورد استفاده قرار گيرد و نيازي به تعويض آن در هر بار رنگ‌آميزي نمي‌باشد. همچنين قبل از قرار دادن ژل در تشتك رنگ‌آميزي به خوبي آن را به هم زده تا رنگ در تمامي قسمت‌ها پخش گردد و باندها به طور يكسان رنگ‌آميزي گردند. محل نگهداري رنگ در قسمتي تاريك و دور از نور آفتاب مي‌باشد. از ريختن آب گرم بر روي رنگ بعد از تعويض و ريختن آن در سينك ظرفشويي جهت جلوگيري از ايجاد بخارات سمي اكيداً خودداري شود. پس از رنگ‌آميزي مرحله شستشو در آب مقطر مي‌باشد به مدت 10 دقيقه ژل را از رنگ خارج و در آب مقطر جهت شستشو شدن قرار مي‌دهيم و پس از گذشتن زمان مذكور آن را بر روي صفحه دستگاه ژل داك قرار داده و از آن عكس گرفته مي‌شود. پس از انجام عكسبرداري و ذخيره كردن، ژل با دستكش درون پلاستيك قرار داده شده و در چاه مخصوص انداخته مي‌شود.
3-8-توالي‌يابي (sequencing)
پس از اتمام PCR، محصولات PCR در فريزر20- نگهداري گرديدند، سپس به همراه پرايمر به شركت پيشگام ارسال گرديد. محصولات PCR توسط اين شرکت براي توالي‌يابي به کشور کره ارسال گرديد. علاوه بر اين براي اطمينان بيشتر توالي ژن مورد نظر در سايت NCBI بلاست گرديد و صحت وجود ژن مورد نظر مورد تاييد قرار گرفت.
3-9-1- روش گرد آوري اطلاعات
ميداني: نمونه برداري از نمونه هاي ادرار مبتلا به عفونت ادراري
کتابخانه اي: انتخاب پرايمرهاي مناسب جهت هدف قرار دادن ژن هاي ويرولانس
آزمايشگاهي: جداسازي ايزوله ها و شناسايي ژن هاي ويرولانس ابزار گرد آوري اطلاعات
1. بانک هاي اطلاعاتي مانند اينترنت
2. نشريات معتبر جهت دستيابي به مقالات مرتبط با موضوع
3. جمع آوري نمونه هاي ادراري به منظور جداسازي اشريشيا کلي

3-9-2- روش تجزيه و تحليل اطلاعات
1. تکثير توالي هاي اختصاصي (ژن هاي ويرولانس) با استفاده از تکنيک PCR
2. تجزيه و تحليل باندها (اثر انگشت با استفاده از نرم افزار Image lab
3. بررسي آماري جهت تجزيه و تحليل داده ها : از نرم افزار SPSS نسخه 18 و همچنين جهت رسم
نمودارها و جداول از نرم افزار Microsoft Office Excel 2013 استفاده شد. مقايسه الگوهاي باندي DNA مربوط به ويرولوتايپ ها با رويت و محاسبه نحوه قرارگيري آن ها در ژل بر اساس وزن مولکولي آن ها ومقايسه با مارکر مولکولي و شمارش باندها جهت هر نمونه صورت گرفت. يک ماتريکس صفر و يک به منظور وجود يا عدم وجود باند تهيه و در پايگاه اينترنتي ثبت شد و ويرولوتايپ ها بر پايه مشاهده ي نحوه قرارگيري آن ها در ژل براساس وزن مولکولي آن ها و مقايسه با مار
کر مولکولي و شمارش باندها جهت هر نمونه انجام گرفت. شمارش سويه هاي واجد ژن ويرولانس و درصد گيري نسبت به کل نمونه ها مبناي درصد شيوع فاکتور ويرولانس مي باشد.
فصل چهارم
نتايج و بحث

4-1- فراواني بيماران بر اساس جنس
در مجموع از کل بيماران که مورد مطالعه قرار گرفتند 18 مورد، 18 درصد مذکر و 82 مورد، 82 درصد مونث بودند.(نمودار 4-1)

نمودار 4-1: فراواني بيماران بر اساس جنس

بيماران بر اساس سن در 4 گروه سني(Age) شامل: کودک کمتر از يک سال، نوجوان، جوان و مسن تقسيم بندي گرديدند. 4 مورد(4%) در گروه سني کمتر از يک سال، 3 مورد (3%) نوجوان، 63 مورد(63%) جوان و 30 مورد(30%) در گروه سني افراد مسن قرار داشتند.(نمودار4-2)

نمودار4-2: فراواني بيماران براساس سن(سال)

4-2-نتايج مربوط به فراواني فاکتورهاي حدت در اشرشيا کلي
بررسي هاي ويرولوتيپينگ ايزوله هاي اشرشيا کلي که توسط تکنيک PCR انجام گرديد نشان داد که 98% از ايزوله ها متعلق به ژن Pap، 95% از ايزوله ها متعلق به ژن aer ، 94% ايزوله ها متعلق به ژن Fim، 86% از ايزوله ها متعلق به ژن cnf ، 63% از ايزوله ها متعلق به ژن Afa ، 62% از ايزوله ها متعلق به ژن hlyA بودند. نمودار(4-3)

نمودار 4-3: نتايج مربوط به فراواني فاکتورهاي حدت در اشرشيا کلي

4-3- نتايج آزمون PCR براي شناسايي ژن آئروباکتين در سويه هاي واجد اشرشيا کلي يوروپاتوژن PCR با کمک پرايمرهاي اختصاصي که در فصل سوم ذکر شد انجام گرديد.

4-3-1-بهينه سازي دماي اتصال
به منظور انتخاب مناسب ترين دماي اتصال، گراديانت دمايي مطابق(تصوير 4-1 ) انجام گرديد. طبق تصوير باندهاي بدست آمده از pcr توسط پرايمر هاي فوروارد و ريورس دماي بهينه 68 درجه سانتي گراد انتخاب گرديد چون وضوح باند در اين دما بهتر بود( نمونه مورد نظر شماره 23 انتخاب گرديد).

تصوير4-1: دماهاي انتخاب شده براي انجام گراديانت دمايي جهت انتخاب دماي اتصال در يک واکنش pcr براي ژن aer، به ترتيب شماره از چاهک 1 الي 4 عبارتند از 69-68-67-66 درجه سانتي گراد و در سمت چپ مارکر مولکولي bp 1000 مي باشد.

4-3-1-1- انجام آزمون روي ساير ايزوله ها
پس از بهينه نمودن روش کار، آزمايش pcr بر روي ساير نمونه ها ي باليني صورت گرفت که با توجه به باندهاي بدست آمده، تصاوير همه باندها واضح بوده و طبق انتظار محصول pcr ما bp 602 تصوير (4-1-1-)(4-1-2-).

تصوير 4-1-1: نتايج pcr به منظور تکثير ژن aer در ساير ايزوله هاي باليني توسط مارکر مولکولي bp 1000 اعداد بالاي چاهکها مربوط به شماره ايزوله ها مي باشد.

تصوير شماره 4-1-2-: نتايج PCR بر روي برخي نمونه هاي باليني. رديف هاي 1 تا 4 نمونه هاي مثبت واجد ژن آئروباکتين و رديف هاي 5 و 6 به ترتيب نمونه کنترل منفي و نمونه فاقد ژن آئروباکتين. رديف MW مارکر مولکولي 1000 جفت بازي مي باشد.

4-3-2- نتايج آزمون PCR براي شناسايي ژن سايتوتوکسيک نکروزدهنده در سويه هاي واجد اشرشيا کلي يوروپاتوژن PCR با کمک پرايمرهاي اختصاصي که در فصل سوم ذکر شد انجام گرديد.
4-3-2-1- بهينه سازي دماي اتصال
به منظور انتخاب مناسب ترين دماي اتصال، گراديانت دمايي مطابق(تصوير 4- 2) انجام گرديد. طبق تصوير باندهاي بدست آمده از pcr توسط پرايمر هاي فوروارد و ريورس دماي بهينه 57 درجه سانتي گراد انتخاب گرديد چون وضوح باند در اين دما بهتر بود( نمونه مورد نظر شماره 5 انتخاب گرديد).

تصوير 4-2: دماهاي انتخاب شده براي انجام گراديانت دمايي جهت انتخاب دماي اتصال در يک واکنش pcr براي ژن cnf، به ترتيب شماره از چاهک 1 الي 7 عبارتند از 57-56-55-54-53-52- 51درجه سانتي گراد و در سمت چپ مارکر مولکولي bp 1000 مي باشد.
4-3-2-2- انجام آزمون روي ساير ايزوله ها
پس از بهينه نمودن روش کار، آزمايش pcr بر روي ساير نمونه ها ي باليني صورت گرفت که با توجه به باندهاي بدست آمده، تصاوير همه باندها واضح بوده و طبق انتظار محصول pcr ما bp 693 تصوير (4-2-1).

تصوير شماره 4-2-1: نتايج PCR بر روي برخي نمونه هاي باليني. رديف هاي C+ و C- به ترتيب کنترل مثبت و منفي، و رديفهاي 1و2،نمونه هاي منفي فاقد ژن و رديف 3 نمونه واجد ژن فاکتور نکروز دهنده سايتوتوکسيک. رديف MW مارکر مولکولي 1000 جفت بازي مي باشد.

4-3-3- نتايج آزمون PCR براي شناسايي ژن هموليزين در سويه هاي واجد اشرشيا کلي يوروپاتوژن PCR با کمک پرايمرهاي اختصاصي که در فصل سوم ذکر شد انجام گرديد.
4-3-3-1- بهينه سازي دماي اتصال
به منظور انتخاب مناسب ترين دماي اتصال، گراديانت دمايي مطابق(تصوير 4-3) انجام گرديد. طبق تصوير باندهاي بدست آمده از pcr توسط پرايمر هاي فوروارد و ريورس دماي بهينه 62 درجه سانتي گراد انتخاب گرديد چون وضوح باند در اين دما بهتر بود( نمونه مورد نظر شماره 5 انتخاب گرديد).

تصوير شماره4-3: دماي مناسب براي ژن hlya 62 درجه سانتي گراد انتخاب گرديد چون وضوح باند در اين دما بهتر بود نيازي به انجام گراديانت دمايي احساس نشد

4-4-4- نتايج آزمون PCR براي شناسايي ژن p-فيمبريه در سويه هاي واجد اشرشيا کلي يوروپاتوژن PCR با کمک پرايمرهاي اختصاصي که در فصل سوم ذکر شد انجام گرديد.
4-4-4-1- بهينه سازي دماي اتصال
به منظور انتخاب مناسب ترين دماي اتصال، گراديانت دمايي مطابق(تصوير 4- 4) انجام گرديد. طبق تصوير باندهاي بدست آمده از pcr توسط پرايمر هاي فوروارد و ريورس دماي بهينه 63 درجه سانتي گراد انتخاب گرديد چون وضوح باند در اين دما بهتر بود( نمونه مورد نظر ش
ماره 2 انتخاب گرديد).

تصوير شماره4-4: دماهاي انتخاب شده براي انجام گراديانت دمايي جهت انتخاب دماي اتصال در يک واکنش pcr براي ژن pap، به ترتيب شماره از چاهک 1 الي 7 عبارتند از 69-68-67-66-65-64-64درجه سانتي گراد و در سمت چپ مارکر مولکولي bp 1000 مي باشد.
4-4-4-2- انجام آزمون روي ساير ايزوله ها
پس از بهينه نمودن روش کار، آزمايش pcr بر روي ساير نمونه ها ي باليني صورت گرفت که با توجه به باندهاي بدست آمده، تصاوير همه باندها واضح بوده و طبق انتظار محصول pcr ما bp 328 تصوير (4-4-1-).

تصوير شماره4-4-1: نتايج PCR به منظور تکثير ژن Pap در برخي ايزوله هاي باليني توسط مارکر مولکولي bp 1000، اعداد بالاي چاهک ها مربوط به شماره ايزوله ها مي باشد.

4-5-5- نتايج آزمون PCR براي شناسايي ژن Afa در سويه هاي واجد اشرشيا کلي يوروپاتوژن PCR با کمک پرايمرهاي اختصاصي که در فصل سوم ذکر شد انجام گرديد.
4-5-5-1- بهينه سازي دماي اتصال
به منظور انتخاب مناسب ترين دماي اتصال، گراديانت دمايي مطابق(تصوير 4- 5) انجام گرديد. طبق تصوير باندهاي بدست آمده از pcr توسط پرايمر هاي فوروارد و ريورس دماي بهينه 65 درجه سانتي گراد انتخاب گرديد چون وضوح باند در اين دما بهتر بود( نمونه مورد نظر شماره 9 انتخاب گرديد).

تصوير 4-5: دماهاي انتخاب شده براي انجام گراديانت دمايي جهت انتخاب دماي اتصال در يک واکنش pcr براي ژن Afa، به ترتيب شماره از چاهک 1 الي 6 عبارتند از 69-68-67-66-65-64درجه سانتي گراد و در سمت چپ مارکر مولکولي bp 1000 مي باشد.

4-5-5-2- انجام آزمون روي ساير ايزوله ها
پس از بهينه نمودن روش کار، آزمايش pcr بر روي ساير نمونه ها ي باليني صورت گرفت که با توجه به باندهاي بدست آمده، تصاوير همه باندها واضح بوده و طبق انتظار محصول pcr ما bp 750 تصوير (4-5-1).

تصوير 4-5-1: نتايج PCR به منظور تکثير ژن Afa در برخي ايزوله هاي باليني توسط مارکر مولکولي bp 1000، اعداد بالاي چاهک ها مربوط به شماره ايزوله ها مي باشد.
4-6-6- نتايج آزمون PCR براي شناسايي ژن Fim در سويه هاي واجد اشرشيا کلي يوروپاتوژن PCR با کمک پرايمرهاي اختصاصي که در فصل سوم ذکر شد انجام گرديد.
4-6-6-1- بهينه سازي دماي اتصال
به منظور انتخاب مناسب ترين دماي اتصال، گراديانت دمايي مطابق(تصوير 4- 6) انجام گرديد. طبق تصوير باندهاي بدست آمده از pcr توسط پرايمر هاي فوروارد و ريورس دماي بهينه 59 درجه سانتي گراد انتخاب گرديد چون وضوح باند در اين دما بهتر بود( نمونه مورد نظر شماره 11 انتخاب گرديد).

تصوير 4-6: نتايج PCR به منظور تکثير ژنFim در برخي ايزوله هاي باليني توسط مارکر مولکولي bp 1000، اعداد بالاي چاهک ها مربوط به شماره ايزوله ها مي باشد.

دیدگاهتان را بنویسید