مقاله رایگان درمورد اشرشيا، کلي، آنتي، باکتري

ا گرديد. باکتري اشرشيا کلي با استفاده از تکنيک هاي بيوشيميايي و ميکروب شناسي استاندارد شناسايي شد. استخراج ژنوم باکتري ها با استفاده از روش جوشاندن انجام گرفت و بررسي وجود و تعيين هويت فاکتورهاي ويرولانس با استفاده از روش PCR انجام گرفت. نتايج: PCR به طور موفقيت آميزي براي تمامي 6 ژن مورد نظر بهينه سازي شد و توانست باندهاي مورد نظررا نشان دهند. عفونت مجاري ادراري ايجاد شده با اشرشيا کلي 83 % برآورد گرديد شيوع ژن هاي ويرولانس به ترتيب شامل:(98%)( bp 328) Pap(95%)(bp 602) aer ،(94%)( bp 559) Fim،(86%)( bp 693)cnf ،(63%)( bp 750)Afa ، (62%)( bp 1177)hlyA به طور موفقيت آميزي تکثير يافتند. بحث: مطالعه حاضر نشان داد که شيوع ژن هاي ويرولانس pap ،aer ، Fimدر ميان سويه هاي اشرشيا کلي يوروپاتوژن جدا شده از بيماران مراجعه کننده به بيمارستان بقيه الله (عج) تهران بالا مي باشد و کمترين شيوع مربوط به ژن hlyA (هموليزين)مي باشد.
کلمات کليدي: اشرشيا کلي يوروپاتوژن، عفونت مجاري ادراري، ژن هاي ويرولانس، واکنش زنجيره اي پليمراز
فصل اول
مقدمه
1-1-بيان مسئله
اشريشيا کلي(E.coli)1 يک باسيل گرم منفي از خانواده انتروباکترياسه است که به طور شايع در روده جانوران خونگرم و برخي پرندگان وجود دارد. انتقال اين باکتري از طريق مسير مدفوعي- دهاني از يک فرد به فرد ديگر و يا از طريق آب و غذاي آلوده مي باشد. اشريشيا کلي به خوبي روي محيط هاي معمولي رشد کرده و يک باکتري کم نياز است و در روي محيط هاي جدا کننده روده اي بيشتر سويه ها کلني هاي تخمير کننده لاکتوز را ايجاد مي کنند (هاملين و همکاران،2007)2. اشرشيا کلي يکي از مهمترين دلايل ايجاد کننده عفونت هاي کليه، مثانه، ريه و مننژ مي باشند که به نوبه خود ممکن است منجر به سپسيس گردند و يکي از مهمترين عوامل تهديد کننده حيات انسان محسوب مي شوند (چانج و همکاران، 2006 )3. عفونت مجاري ادراري(UTI)4 يکي از شايع ترين عفونت هاي باکتريايي در انسان است که به طور عمده توسط اشرشيا کلي ايجاد مي شود(گريبلينگ و توماس، 2005)5. عفونت هاي ادراري از لحاظ شيوع، رتبه دوم را پس از عفونت هاي تنفسي داشته و در بزرگسالان رتبه اول بيماري هاي عفوني بزرگسالان را از نظر مراجعه به پزشک تشکيل مي دهند. به اين ترتيب اهميت عفونت هاي ادراري از نظر عوارض بسيار جدي که در نتيجه عدم تشخيص درمان مناسب بر جاي مي گذارد بر کسي پوشيده نيست در ارزيابي تکامل ژنتيکي اشرشيا کلي، بررسي هاي فيلوژنتيکي از اهميت خاصي برخوردار است. اشرشيا کلي عامل 90-80 درصد از عفونت مجاري ادراري اکتسابي از جامعه و 50-30 درصد از عفونت مجاري ادراري بيمارستاني است(نعمتي و همکاران، 2014).
1
2 عفونت مجاري ادراري از علل عمده بستري شدن در بيمارستان با عوارض قابل توجه و هزينه هاي مراقبت بهداشتي است(نعمتي و همکاران، 2014 ). تشخيص و درمان موثر عفونت مجاري ادراري يک نگراني بزرگ در زمينه ي مراقبت هاي بهداشتي است(سنتيلو و فرانکلين، 2007)1. در سراسر جهان حدود 150 ميليون نفر با عفونت مجاري ادراري تشخيص داده شده اند که هر ساله هزينه اقتصادي در اين زمينه بيش از 6 ميليارد دلار در جهان مي باشد (کومار و همکاران، 2006)2. شدت عفونت مجاري ادراري به دو عامل ويرولانس باکتري و حساسيت ميزبان بستگي دارد(گريبلينگ و توماس، 2005). اشرشيا کلي ايجاد کننده ي عفونت مجاري ادراري UPEC))3 فاکتورهاي ويرولانس مختلفي از جمله آلفا هموليزين، فاکتور نکروز دهنده سايتوتوکسيک، چسبنده ها و سيستم هاي اکتساب آهن دارد; اين فاکتورها در نهايت منجر به آسيب بافتي مي شوند(پيت آئوت، 2012)4. اتصال باکتري به سلول هاي اورو اپي تليال يک مرحله ضروري براي شروع و گسترش است. اين فرايند به باکتري اجازه مي دهند تا در مقابل عملکرد شستشوي ادرار و تخليه مثانه و فعال شدن مسيرهاي انتقال پيام در ميزبان مقاومت کند. سويه هاي اشرشيا کلي يوروپاتوژن قادر هستند تا انواع متفاوتي از چسبنده هاي لازم براي تشخيص و اتصال به رسپتورهاي مجاري ادراري را توليد کنند: از جمله فيمبريه تيپ 1 که توسط ژن fim کد مي شود، P فيمبريه که توسط ژن هاي pap (phylonephritis-associated pili) کد مي شود، S فيمبريه که توسط ژن هاي sfa کد مي شود و چسبنده ي Afa که توسط ژن هاي afa کد مي شود(آنتااو و همکاران، 2009)5. توليد توکسين ها مانند هموليزين و سايتوتوکسيک نکروز دهنده فاکتور 1(CNF1 ( باعث آسيب بافتي مي شود که انتشار باکتري و ترشح مواد غذايي ميزبان را تسهيل مي کنند و ممکن است همچنين باعث تغيير مسيرهاي انتقال پيام در ميزبان شود(توماس و همکاران، 2011)6. از ديگر خصوصيات UPEC براي ايجاد عفونت مجاري ادراري سيستم اکتساب آهن است که باکتري با کمک سيدروفورها آهن را از محيط جذب مي کند. ژن aer سيدروفور آئروباکتين را کد مي کند (نعمتي و همکاران، 2014).
1-2- اهميت و ضرورت تحقيق
تحقيق فوق از آن جهت حائز اهميت نو آوري است که تاکنون در خصوص شناسايي ژن هاي پاتوژنيسته و ويرولوتيينگ ايزوله هاي جداشده از منابع يوروپاتوژن عفونت هاي ادراري اشرشيا کلي تحقيقي جامع در برخي بيمارستان ها از جمله بيمارستان بقيه الله (عج) تهران انجام نشده است و ما قصد داريم اين تحقيق را براي اولين بار در اين بيمارستان به انجام برسانيم.

1-3-اهداف تحقيق:

اهداف علمي:
1. تعيين فراواني ژن هاي مرتبط با بيماري زايي سويه هاي اشرشيا کلي يوروپاتوژن جداشده از بيماران مراجعه کننده به بيمارستان بقيه الله(عج) تهران.
2. تعيين ويرولوتيپ هاي سويه هاي اشرشيا کلي جدا شده از بيماران بيمارستان
بقيه الله (عج) تهران.
3. تعيين رابطه ي بين ژن هاي پاتوژنيسته خاص با سويه هاي جدا شده از اشرشيا کلي يوروپاتوژن از بيماران بيمارستان بقيه الله (عج) تهران.

اهداف کاربردي:
راه اندازي روش هاي سريع شناسايي ژن هاي پاتوژنيسته و تعيين ويرولوتيپ هاي سويه ها

1-4- فرضيه هاي تحقيق:
1. سويه هاي اشرشيا کلي يوروپاتوژن جدا شده از عفونت هاي ادراري داراي ژن هاي ويرولانس خاصي مي باشند.
2. انتظار مي رود فراواني ژن هاي ويرولانس باکتري اشرشيا کلي در ايران همانند کشورهاي ديگر باشد.
3. بين حضور ژن هاي خاص ويرولانس و منبع جداسازي باکتري ها رابطه وجود دارد.

1-5- تاريخچه
اشرشيا کلي اولين بار به وسيله پزشکي آلماني به نام تئودر اشريش1شناسايي شد. او در سال 1885، اين ارگانيسم را باکتريوم کلي 2 ناميد و آن را به عنوان عامل بيماري زاي اصلي عفونت هاي روده اي و برخي از عفونت هاي خارج روده اي معرفي کرد. نام باکتريوم کلي به طور وسيع تا سال 1919 استفاده مي شد تا وقتي که کاستلائي 3 و کالمرز4جنس اشرشيا را تعريف کردند و نام اشرشيا کلي را پايه نهادند. 3
اشرشيا کلي4ارگانيسمي است که به شدت از جنبه هاي مختلف مورد مطالعه قرار گرفته است. در باکتريولوژي عمومي به عنوان ارگانيسم مدل براي مطالعه ي ساختار سلولي، رشد ومتابوليسم استفاده مي شود، همچنين ابزاري بسيار مهم براي کلونينگ ژن ها در سلول هاي پروکاريوتي و يوکاريوتي و بيان محصولات ژن ها شده است. اشرشيا کلي به عنوان ارگانيسم کنترلي جهت انجام آزمايشهاي کنترلي موثر بودن عوامل ضد ميکروبي و مواد ضد عفوني کننده استفاده مي شود و به عنوان ارگانيسم انديکاتور جهت تعيين آلودگي مدفوعي، مواد غذايي، آب و محيط مطرح مي باشد و نقش مهمي را به عنوان فلور ميکروبي روده ي انسان و حيوانات خونگرم تشکيل مي دهد. کم و بيش برخي از سويه هاي پاتوژن هاي مهمي براي ميزبان هايشان هستند.

1-5-1- خانواده انتروباکترياسه
خانواده انتروباکترياسه بزرگترين و ناهمگون ترين مجموعه ي باسيل هاي گرم منفي هستند که از لحاظ باليني اهميت دارند. حداقل 28 جنس و 7 گروه روده اي5 با بيش از 80 سويه شناخته شده است. جنس هاي اين خانواده بر اساس خصوصيات بيوشيميايي، ساختار آنتي ژني و ترادف يابي اسيدهاي نوکلئيک طبقه بندي شده اند. باکتري هاي متعلق به انتروباکترياسه گسترش جهاني داشته و ساکن روده ي حيوانات و انسان ها هستند و گياهان، خاک و آب را آلوده مي سازند. آن ها بسياري از بيماري هاي باليني از قبيل آبسه، پنوموني6، مننزيت، سپتي سمي و عفونت هاي اداري را باعث مي شوند(عموئيان و ميبدي، 1383). باکتري هاي خانواده انتروباکترياسه را به دو دسته باکتري هاي فرصت طلب و بيماري زاي روده اي تقسيم مي کنند که برخي از جنس هاي اين خانواده مثل سالمونلا، شيگلا و يرسينا هميشه مرتبط با بيماري هستند و جز پاتوژن هاي روده اي مي باشند ولي برخي ديگر مانند اشرشيا کلي، کلبسيلا و پروتئوس به عنوان فلور طبيعي روده بوده و با ايجاد شدن شرايطي مانند کسب ژن هاي بيماري زايي از طريق پلاسميد و باکتريوفاژ، به هم خوردگي فلور ميکروبي، جابجايي فلور ميکروبي و غيره، قدرت بيماري زايي را به دست آورده و سبب ايجاد عفونت هاي فرصت طلب مي شوند.5
1-5-2- اشرشيا کلي
اشرشيا کلي شايع ترين و مهمترين جنس در خانواده انتروباکترياسه مي باشد که در پزشکي اهميت دارد. اشرشيا کلي باکتري بي هوازي اختياري و بخشي از فلور فيزيولوژي روده اي در انسان و حيوانات خونگرم است اما برخي از سويه ها سبب بيماري هايي مثل پنوموني، گاستروانتريت1، بيماري هاي ادراري -تناسلي و سپتي سمي مي شوند. چندين واريانت پاتوژن اجباري و اختياري از اشرشيا کلي وجود دارد که باعث انواع مختلفي از عفونت هاي روده اي و خارج روده اي در انسان و حيوانات مي شود. در سال هاي اخير سويه O157:H7 اشرشيا کلي به عنوان پاتوژن مهم مشترک بين انسان و دام مطرح گرديده، که از طريق غذا منتقل مي شود. اين سويه عامل سندرم اورمي هموليتيک -کوليت خونريزي دهنده 2 در انسان است (عادلي، 1386).

1-5-3- طبقه بندي
براي اولين بار دسته بندي اشرشيا کلي بر اساس تيپ هاي متنوعي از آنتي ژن سوماتيک O توسط کائوفمن3 انجام گرفت. برخي محققين چندين گونه براي آن قائل اند : اشرشيا هرماني4، اشرشيا دکربوکسيلاتا5، اشرشيا ولنزي6، اشرشيا فرگوسني7، اشرشيا کلي و اشرشيا بلاته8، که بين اين ها گونه اخير از موارد انساني جدا نشده است. در کتاب Bergeys Manual که در سال 1984 چاپ شد، بر اساس يافته هاي DNA در خانواده انتروباکترياسه 20 جنس قرار گرفت (رحيمي، 1387 ).6
* طبقه بندي اشرشيا کلي بر دو اساس صورت مي گيرد:
1. بر اساس ساختار آنتي ژني
2. بر اساس Colicin typing (شناسايي کلي سين ها)

1-5-3-1- ساختار آنتي ژني اشرشيا کلي
آنتي ژن هاي سطحي در اشرشيا کلي را مي توان به وسيله آزمايش هماگلوتيناسيون نشان داد: سه نوع آنتي ژن سطحي بطور گسترده براي تعيين سروتيپ ارگانيسم هاي انتريک استفاده مي شوند که شامل آنتي ژن هاي سوماتيک 1 (آنتي ژن (O، آنتي ژن کپسولي ( آنتي ژن K ) و آنتي ژن تاژکي ( آنتي ژن H ) مي باشند(تصوير شماره1-1). آنتي ژنF يا فيمبريه اي، نيز جزء آنتي ژن هاي سطحي است که در برخي از سروتيپ ها يافت مي شود.

1-5-3-2- ساختار آنتي ژن سوماتيک يا آنتي ژن O
آنتي ژن سطحي O، بخشي از ليپو پلي ساکاريد 2 يا LPS جدار باکتري است. LPS، مجتمع گليکوليپيدي جدار باکتري هاي گرم منفي است و از سه ساختار مشخص
تشکيل شده است :
الف- هسته مرکزي پلي ساکاريدي، که يک قند 8 کربني به نام کتودزاکسي اوکتونات است و به آنتي ژن اختصاصيO متصل مي شود.
ب- ليپيد A که به هسته مرکزي متصل مي شود و بروز تاثيرات بيولوژيکLPS باکتري هاي گرم منفي ناشي از اين بخش از باکتري است و درواقع اندوتوکسين باکتري محسوب مي شود. ليپيد A مي تواند باعث تب، لوکوپني و حتي نهايتاً مرگ شود.
ج – آنتي ژن اختصاصي O، که پليمري از واحد هاي تکراري اليگوساکاريدي است و به خاطر تفاوت آن در سويه هاي مختلف، در تعيين سروتيپ حائز اهميت است.
به نظر مي رسد طول زنجيره جانبي اختصاصي Oو انتشار آن در سطح باکتري در مقاومت نسبت به کمپلمان نقش داشته باشد، يعني سويه هايي که بيش از 20 درصد از زنجيره هاي مولکولي LPS آن ها طويل هستند نسبت به تاثير سرم مقاومند، در حالي که سويه هايي که کمتر از 20 درصد زنجيره هاي مولکولي LPS آن ها طويل باشد، نسبت به سرم حساس هستند. بر همين اساس، اخيراً آنتي بيوتيک هايي طراحي شده است که با بيوسنتز پلي ساکاريد مرکزي LPS تداخل مي کنند.7
همچنين بيان شده که در بين باکتري هاي روده اي، اجرامي که آنتي ژن هاي سوماتيک آن ها داراي گروه هاي فوق العاده هيدروفوبيک 3 ( قندهاي دي دزاکسي ) باشند، بيماري زا تر هستند. آنتي ژن هاي O مقاوم به حرارت هستند و در دماي 100 درجه سانتي گراد براي 5/2 ساعت هم غير فعال نمي شوند (کويين و همکاران، 1386)4.
آنتي ژن O در تنوع آنتي ژني شرکت دارد و باعث القاء پاسخ هاي سيستم ايمني ميزبان مي شود. غربالگري سروگروه هاي سوماتيک اشرشيا کلي يک روش متداول در شناسايي اشرشيا کلي است. به طوري که براساس آنتي ژن O اشرشيا کلي 14 سروتيپ را ايجاد مي کند که شامل O1, O2, O4, O6, O7, O8, O15, O16,O18, O21, O22, O25, O75, O85 مي باشند. آنتي ژن سوماتيک به عنوان آنتي ژن اختصاصي در هر جنس مطرح مي باشد، اما واکنش متقاطع بين جنس هاي بسيار نزديک (سالمونلا با سيتروباکتر1 و اشرشياکلي با شيگلا) شايع مي باشد (موري، 1389; بران و همکاران، 2002)2.
1-5-3-3- ساختار آنتي ژن کپسولي يا آنتي ژن k
اين آنتي ژن در اکثر جنس هاي خانواده انتروباکترياسه به صورت يک لايه چسبنده همگن اطراف باکتري را فرا گرفته و روي آنتي ژن O قرار دارد و نسبت به حرارت حساس است و به طور معمول براي تيپ بندي سويه ها استفاده نمي شود، اما از اين جهت اهميت دارد که ممکن است در تشخيص آنتي ژن O اختلال ايجاد کند پادگن کپسولي k که گاهي به آن پادگن پوششي هم مي گويند، روي پادگن هاي O قرار گرفته و مانع آگلوتيناسيون 3 آن با آنتي سرمO 4 مي شوند. با جوشاندن سوسپانسيون ارگانيسم به منظور از بين بردن آنتي ژن K (که حساس به حرارت است ) و باقي ماندن آنتي ژن O (مقاوم به حرارت ) در حرارت زياد مي توان بر اين مشکل فايق آمد(کويا، 1998). ماهيت اين گروه پادگني پلي ساکاريدي بوده که با حرارت دادن، تغيير يافته و در نتيجه آگلوتيناسيون بين آنها رخ مي دهد. در طي تحقيقات اخير مشخص شده است که پادگن هاي K در سويه هاي خاصي از اشرشيا کلي ماهيت پروتئيني دارد. فيمبريه هاي K99 و K88 جدا شده از حيوانات و پادگن هاي عوامل سيطره اي جدا شده از

دیدگاهتان را بنویسید