دانلود فرمت word : دانلود گزارشات آزمايشات ميكروبيولوژي محيطي – قسمت اول

عنوان آزمايش : 1- جمع آوري و نگهداري نمونه هاي خاك

2 – تهيه لام هاي دفن شده در خاك

آشنايي با روش نمونه برداري، نگهداري و تهيه لام از خاك

ميكرو بيولوژي و شيمي خاك حايز اهميت مي باشند كه بر اساس اصول صحيح جمع آوري و نگهداري كرده و آزمايش مورد نظر را انجام مي دهيم نكته مهم اينكه خاك مانند محيطهايي می باشد كه حتي در يك محدوده معين ويژگيها و شرايط آن از نظر فيزيكي- بيولوژيك و شيميايي با همديگر فرق دارند. مثلاً در يك محدوده خاص مثل بلندي تپه در مقايسه با ارتفاع كم ويژگيهاي متفاوت مي باشد و حتي در يك باغچه كه به آن كود داده مي گردد جاهايي كه كود بيشتري دريافت كرده و يا كمتري دريافت كرده شرايط متفاوتي دارد، بنابراين تهيه اين نمونه ها يا به مقصود انجام آزمايشهايي ميكرولوژي انجام مي گردد و يا آزمايشهاي شيميايي كه اين دو تفاوتي كوچك از نظر جمع اوري و نگهداري دارند. براي نمونه برداري و جمع آوري از دستگاههاي نمونه بردار خاصي آگلر بهره گیری مي گردد كه غالباً نوعي لوله نمونه برداري می باشد كه طول و قطر مشخص دارد و جنس آن عموماً فلزي مي باشد و ويژگي كه دارند روي سطح آنها مدرج شده می باشد كه به مقصود اندازه گيري از عمق مورد بهره گیری قرار مي گيرد كه به شكل عمودي بر روي نقطه اي كه براي برداشت نمونه مشخص شده می باشد قرار گرفته می باشد و با فشار دادن دست يا فشارمكانيكي در خالك فرورفته تا عمق مورد نظر ازخاك پر مي شوند و بعد محتويات آنها با يك ظرف ترجيحاً استريل يا يك كيسه پلاستيكي منتقل مي شوند.

نکته مهم : برای بهره گیری از متن کامل پژوهش یا مقاله می توانید فایل ارجینال آن را از پایین صفحه دانلود کنید. سایت ما حاوی تعداد بسیار زیادی مقاله و پژوهش دانشگاهی در رشته های مختلف می باشد که می توانید آن ها را به رایگان دانلود کنید

مرحله دوم نگهداري نمونه ها مي باشد كه اگر مجبور به نگهداري شويم بايستي نمونه هاي جمع آوري شده در شرايطي كه از نظر دما و رطوبت تشابه زيادي با زمان برداشت نمونه دارند نگهداري شوند كه مثلاً در مورد نمونه هاي ميكروبي دماي مشابه دماي برداشت نمونه مناسب بوده كه فعاليت ميكرو ارگانسيم ها را كند مي كند در مورد آزمايشهاي شيميايي روشهايي مانند منجمد كردن و خشك كردن براي نگهداري مورد نظر مي باشد .

مرحله انجام آزمايش:

براي شروع كار آغاز يك نقطه مناسب را براي برداشت نمونه در نظر مي گيريم و در مرحله اول بايد يك برچسب تهيه كرده و مشخصات دقيق محل برداشت نمونه را روي آن برچسب مي نويسيم يعني اينكه اگر براي برداشت مجدد نياز باشد بايستي بتوانيم نمونه برداري را عيناً تكرار كنيم كه بتدريج فناوريهاي جديد مثل   GPS نيز مورد بهره گیری قرار مي گيرد در درجه دوم مشخصات ظاهري خاك را بايستي يادداشت كنيم كه شامل: نوع دانه بندي خاك- پستي و يا بلندي – خشكي و ديگر مشخصات و بعد از مدتي كه مراجعه كرديم متوجه تغييرات آن شويم معمولاً اين برچسبها حاوي تاريخ، شرايط اقليمي، نام نمونه بردار و هر اطلاعات ديگري كه لازم بوده و به تفسير نتايج آزمايش كمك كند مي باشد.

شما می توانید مطالب مشابه این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید                     

انجام آزمايش:

پس از تحويل گرفتن وسايل مورد نياز شامل يك كيسه نايلون تميز و دماسنج و تيغه محل نمونه برداري پشت آزمايشگاه كنار درخت بزرگ زبان گنجشك و قسمت شمال غربي آن تعيين گرديد و ضمن مراجعه در محل با بهره گیری از لوله مخصوص كه براي نمونه برداري پيش بيني شده بود با فشار مكانيكي در محل مورد نظر اقدام به نمونه برداري و تخليه آن داخلا يك پلاستيكي گرديد البته قبلاً با بهره گیری از دما سنج مخصوص و با فرو كردن آن در داخل و ايست چند دقيقه اي درجه حرارت خاك تعيين گرديد سپس درجه حرارت هوا نيز اندازه گيري و بود. پس از ثبت مشخصات شامل 1- نام نمونه بردار: علي اكبر نوروزي 2- ساعت 15/15 روز دوشنبه 3/12/84 3- مكان: آموزشكده محيط زيست پشت آزمايشگاه ميكرولوژي جنب درخت بزرگ زبان گنجشك و قسمت شمالي آن 4- درجه حرارت هوا 5- درجه حرارت خاك 6- شرايط اقليمي : هوا مرطوب و پس از حدود ده ساعت بارندگي متناوب

در مرحله بعد از تحويل گرفتن يك عدد بوكال ( وسيله قراردادن خاك و لام ها و تماس آنها با همديگر به مقصود ايجاد تماس مناسب محيط كشت با خاك) و 6 عدد لام يا اسلايد كه با بهره گیری از ميكروفيلم آنها را به هم چسباند هو نفوذ ناپذيري آن را تضمين مي كنيم كه يك طرف آنها را با سواپ كه قبلاً با بهره گیری از محيط كشت نوترينت براث (NB) آغشته مي كنيم ( در شرايط استريل)

پس از آماده كردن سه عدد اسلايد دو طرفه كه يك طرف آن آغشته به محيط كشت NB  مي باشد آنها را با فاصله در داخل بوكال قرار مي دهيم و سپس با بهره گیری از قاشقك ميان آنها را با آرامي با خاك پر مي نماييم و درب بوكال را بسته و در دماي گرما گذاري مي كنيم كه اگر شرايط دماي اطاق اين باشد مطلوب می باشد در غير اينصورت آن را داخل انكوباتور به مدت دو هفته قرار مي دهيم تا ميكروارگانيم ها روي آن رشد كند.

عنوان آزمايش: الف) شمارش باكتريهاي هتروتروف هوازي خاك به روش plate

count

هدف: آشنايي با روش كلاسيك شمارش باكتريهاي زنده

تاريخ: 10/12/84

انجام آزمايش:

باكتريها غالبترين جمعيت ميكروارگانيم هاي خاك را تشكيل مي دهند و در خاكهاي معمولي بين عدد در هر گرم خاك موجود مي باشند در خاكهاي فاضلاب و لجن فعال يا كشاورزي يا كود دهي بالا با ميكروبي بالايي دارند.

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را در شماره بندی انتهای صفحه بخوانید              

بهره گیری از رفتهاي متوالي و كشت در پليت به روش pour plate مي باشد خاك بدليل اينكه داراي باكتريهاي زيادي مي باشد قابل كشت بصورت مستقيم نمي باشد لذا آغاز سوسپانيون را تهيه و با بهره گیری از مايع مناسب كه آسيبي به سلولها نرساند ماده جامد را وارد آن مي كنيم و با بهره گیری از روشهاي مكانيكي آن را به هم مي زنيم يا با بهره گیری از دستگاهي بنام shaker كه با دور مشخص ( مثلاً 2000RPM يادويست دور در دقيقه ) به مدت ده دقيقه كه سلولها به هم چسبيده جدا و معلق شوند البته اين روش علاوه بر خاك در مواد غذايي نيز مورد بهره گیری دارد . روش مناسب دقيق سازي تهيه وقتهاي متوالي می باشد كه مايع مناسب براي آن سرم فيزيولوژيك يا آب مقطر مي باشد.

دقت                       (خاك) سرم فيزيولوژيك

كه به ازاي هر رقت يك پليت خالي استريل در نظر مي گيريم البته صحيح آن 3 دست براي هر لوله مي باشد كه به توضیح ذيل مي باشد كه اين اقدام با بهره گیری از پييت مدرج استريل و يا رعايت شرايط سترون صورت مي گيرد

پس از تلقيح نمونه ههاي رقيق شده بر روي هر يك از پليت هاي استريل بر روي هر پليت محيط كشت كه قبلاً آماده كرده ايم ( N.A) ريخته و آن را با حركات 8 مانند زيگزاگي به هم مي زنيم تا كاملاً مخلوط شوند پس آنها را با ثبت مشخصات گروه در دماي به مدت 24 تا 48 ساعت در داخل انكوباتور گرما گذاري مي‌كنيم.

ب) عنوان آزمايش: تعيين PH و در صد رطوبت خاك براي اندازه گيري PH آغاز 5 گرم از خاك را در داخل استوانه مدرج ( مزور) كه آب مقطر در داخل آن ريخته شده می باشد و به داخل بشر مي ريزيم البته آب مقطر بايستي به آرامي روي خاك ريخته گردد و با بهره گیری از ميله شيشه اي به هم مي زنيم و مي گذاريم تا كاملاً ته نشين گردد و بعد با بهره گیری از PH متر آن را اندازه مي گيريم البته الكترود آن بيايستي به ته تشر بچسبد.

PH=7027

براي اندازه گيري رطوبت خاك 100g خاك را داخل يك بشر مناسب كه قبلاً وزن شده می باشد اندازه مي گيريم :

X= وزن خاك+ وزن بشر

پس نمونه را با بشر به مدت 24 ساعت در دماي قرار مي دهيم و پس ازخارج كردن آن را وزن مي كنيم

درصد رطوبت خاك= 100 رطوبت خاك = وزن بشر با خاك – X

عنوان آزمايش: 1- نظاره لام هاي دفن شده در خاك

2- شمارش و تعيين تعداد باكتريهاي هتروتروف هوازي در خاك

باكتريها به صورت اتفاقي در محيط وجود ندارد و بصورت تحمعي هستند و در خاك هم ترجيح مي دهند با بهره گیری از سطوحي كه در خاك هست در صورت امكان اطراف جمع شده و توده ها و تجمعاتي ايجاد كنند. به هر حال خاك نسبت به محيط سنتزي امكاناتش محدودتر می باشد و كلونيهاي مشخص و بزرگي را كه روي يك محيط كشت ديده مي گردد در خاك نظاره نمي گردد به همين جهت به آنها ميكروكلوني گفته مي گردد يكي از روشهاي مطالعه ميكروبها در خاك بهره گیری از سطح مصنوعي در خاك و ايجاد ميكرو كلوني مي باشد كه اين اقدام با بهره گیری از اسلايد‌هاي كليشه اي روي يك طرف لام كه ماده غذايي روي آن قرار داشته می باشد را رنگي آميزي كرده و ميكروكلوني را مي بينيم. خارج كردن اسوايه با يستي به آرامي صورت بگيرد و توصيه اين می باشد كه روي يك تكه روز نامه با يك ميله شيشه اي خاك اطراف اسلايد را كنار مي زنيم و پس از آزاد سازي آن را بيرون مي آوريم پس از آن يك لبه اسلايد كه به پارافيلم چسبيده گرفته و روي روزنامه بازتر ديگر ضربه مي زنيم به روي ميز تا خاكهاي به هم چسبيده جدا شوند پس پارافيلم را جدا كرده و سطح خارجي آغشته به سلولها و سطح داخلي كاملاً تميز می باشد سطح داخلي ( تميز) : به مقصود فيكس شدن سلولها سه بار روي شعله گرفته و فيكس مي كنيم و رنگ آميزي G انجام مي دهيم و پس از آن زير ميكروسكوپ نظاره مي كنيم كه در نهايت قارچ ميسليوم قرمز ديده مي گردد.

ياد آوري مراحل انجام رنگ امزي G : 1- كريستال ويوله 60 ثانيه 2- شستشو با آب مقطر 3- ايودين 60 ثانيه 4- شستشوي با آب مقطر 5- الكل واستن 6-5 ثانيه 6- سافرانين 45-30 ثانيه 7- شسشو با آب مقطر.

انواعي از تراكمها كه قابل نظاره مي باشد: 1 – ريسه قارچها كه ميسليوم قارچي بوده وچون اولين رنگ را جذب مي كند آب نظاره مي گردد و بدليل اينكه و مختص باكتريها ست و قارچ پپتيد و گليكان ندارد كه در شكل ديواره عرض ميسليوم به شكل منشعب مي باشد و اگر به خوبي رشد كند اسپور آن به خوبي قابل نظاره می باشد

3- اكتينو ميستها كه باكتريهاي گرم مثبت و ظاهر رشته اي هستند و تقريباً شبيه ميسليوم قارچها مي باشند م مهمترين تفاوت آن اين می باشد كه قطر رشته اي خيلي ظريف تر از قارچها مي باشد و قارچها قطورتر و منشعب تر هستند.

4- ويروسها كه ديده نمي شوند   5- گاهي اوقات اگر خاك خيلي مرطوب باشد پروتوزوئرها ديده مي شوند

ادامه كار هفته قبل:

پليت ها را به ترتيب افزايش دقت 1-تا 6- به ترتيب كوچك شدن قرار مي دهيم كه بايستي تراكم كلونيهاي رشد كرده كمي با گردید و شمارش را با شيوه ذيل شروع مي كنيم البته بهترين روشهاي شمارش نيز خالي از خطا نمي باشد كه عبارت می باشد از : الف) كم بودن رقت ها ( خطاي انساتي) ب) خود محيط كشت ممكن می باشد براي همه باكتريها قابل بهره گیری نبوده باشد ج) اگر خطا ها را به حداقل برسانيم مي توانيم اين كار را با دقت بيشتر انجام داده و به نتيجه بهتر برسيم

لخوه شمارش: از مجموع پليت هاي كشت داده شده يكي را انتخاب مي كنيم و از قطر تراكمي كه بين 300-30 كلوني داشته باشد زيرا اگر كمتر از 30 تا باشد احتمال انتقال آلودگي محيط و بالعكس هست و قابل استناد نيست و اگر بيشتر از 300 مورد باشد ظرفيت ظرف بيش از آن نمي باشد. واحد شمارش آن C. . F.U

(Colony forming   uhit) و اساس آن بر اين می باشد كه هر كلوني نماينده يك سلول مي باشد كه لازم آن جدا شدن سلولها از خاك با شرايط قابل قبول می باشد اگر تعداد كلونيها را دقيق بشماريم مثل اين می باشد كه تعداد سلولها را شمارش كرده ايم كه در بعضي آزمايشگاهها از دستگاه كلوني شمار (   Colony counter) بهره گیری مي گردد . روي پليت نور مناسب تابيده شده و با بهره گیری از يك قلم الكترونيكي كلوني شمارش مي گردد و قلم روي شيشه علامت گذاري كرده و احتمال شمارش مجدد از بين مي‌رود.

در روش دستي پشت پليت را با ماژيك وايت برد به چند قسمت تقسيم كرده و شمارش را از بالا پايين شروع مي كنيم البته يك خط را به صورت مشخص و قراردادي بايستي با خانه بالايي يا پايين محاسبه كرد و براي كاهش خطاها سه بار اين كار را انجام مي دهيم و ميانگين ميگيريم پليت انتخاب شده مربوط به    مي باشد

CFU       

عنوان آزمايش : 1- تهيه ميكروكالچر ( اسلايد كالچر ) يا ميكروكشت

هدف: تهيه نمونه مناسب براي نظاره قارچ ريسه اي

تاريخ 10/12/83

ظاهركلوني كپك توده اي در هم رفته از ميسليوم قارچ مي باشد برداشتن يك ميسليوم و جداكردن آن مشكل مي باشد و روش اسلايه كالچه نمونه هاي ميكروسكوپي مناسب از كپكها تهيه مي گردد و اصطلاحاً روش كشت روي لام نيز گفته مي گردد كه در واقع قطعه اي از محيط كشت را روي يك لام ميكروسكوپي قرار داده و با پوشاندن آن كه قبلاً توسط محيط كشت تلقيح شده می باشد قارچ از يك طرف چسبيده به محيط كشت مي دهد. بدين مقصود آغاز با چاقوي مخصوص به اندازه لازم به صورت چهارگوش در محيط كشت برش داده و با رعايت شرايط سترون بر روي لام قرار مي دهيم و به داخل پليت روي شيشه سه گوش مستقر مي كنيم ( محيط كشت مورد بهره گیری در اين روش SDA می باشد) و سپس با رعايت شرايط لازم با بهره گیری از سوزن كه نوك آن را با بهره گیری از حرارت استريل مي كنيم قارچ را از محيط كشت قبلي برداشته و كناره هاي محيط كشت SDA روي لام به صورت SDA تلقيح مي كنيم كه نبايستي زياد برش بخورد زیرا زودتر خشك مي گردد ولي اگر كمتر برش بخورد رشد نمي كند و اگر اندازه محيط كشت برداشتي خيلي كوچك باشد تبادل هوا مشكل و مقدار غذا كم مي‌باشد ولي اگر اندازه محيط كشت برداشتي مطلوب نخواهد بود سپس لامل را روي آن قرار داده و درب پليت را بسته و پس از اين مراحل پليت را به مدت يك هفته در درجه حرارت 27-25 درجه سانتي گراد ( دماي اتاق يا انكوباتور ) گرماگذاري مي‌كنيم البته بايستي قبل از اين اقدام مقداري آب مقطر داخل پليت زير ميله سه گوش شيشه اي تلقيح كنيم تا رطوبت تعادل داشته باشد

عنوان آزمايش 2- MPN (Most Probable Number)  

هدف : آشنايي با روش استاندارد تعيين آلودگي ميكروبي آب

اين روش به مقصود رد يابي و شناسايي و تعيين احتمالي آلودگي آب با فاضلاب مي‌باشد.

با اين آزمايش باكتريهايي كه منشأ آنها دستگاه گوارش بشر و جانواران خونگرم ميباشد در آب شناسايي كرد. آزمايش MPN از سه مرحله: احتمالي، تأييد و تكميلي تشكيل شده می باشد . در مرحله احتمالي با در نظر داشتن نمونه و منشأ باكتري آلوده به كلي فرم باشد بررسي احتمال وجود مي باشد نمونه ها را در محيط كشت لاكتوز براث كشت مي دهيم دراين مرحله از لوث خص توليد اسيد و تغيير رنگ كه نشان دهنده مصرف قند لاكتوز توسط باكتريهاي كلي فرمي می باشد و همچنين توليد گاز و جمع شدن آن در لوله دور هام ( لوله اي كوچك كه در داخل لوله آزمايش بصورت معكوس در داخل نمونه قرار داده مي گردد) كه هر چند بالاتر باشد نشانگر فعاليت بيشتر باكتريها و تعداد بيشتر آنها مي باشد. البته در اين آزمايش از  L-T-B ( لوريل تريپتوبراث ) بهره گیری شده می باشد.

روش كار:‌روش كار بدين صورت مي باشد كه آغاز 9 لوله سه تايي را انتخاب كرده و به ترتيب در سه لوله اول به هر كدام از لوله ها با غلظت دو برابر از محيط كشت مي ريزيم و به سه لوله دوم از غلظت يك يا غلظتي كه توسط كارخانه سازنده اعلام شده می باشد به هر كدام از لوله ها اضافه مي كنيم و به سه لوله سوم نيز مثل سه لوله دوم اقدام مي كنيم سپس به سه لوله اول در شرايط سترون و كنار شعله با بهره گیری از پپيت استريل به هر كدام از نمونه آب را تلقيح مي كنيم سپس به سه لوله دوم به هر كدام از لوله ها cc 1 از نمونه آب به هر كدام از لوله ها اضافه مي نماييم لازم به ذكر می باشد كه هنگام برداشت نمونه توسط پيپت و اضافه كردن آن داخل محيط كشت لوله هاي حاوي نمونه بايستي تكان داده گردد تا باكتريها يكنواخت توزيع شده باشند. به سه لوله سوم از نمونه 1 در شرايط استريل و كنار شعله با پيپيت استريل اضافه كرده درب آن را با پنبه خودش مي بنديم و نمونه ها را به مدت 24 تا 48 ساعت در دماي گرماگذاري ( در داخل انكوباتور) مي كنيم. پس از مدت لازم و خوانده لوله ها نظاره گردید كه در سه لوله اول هر سه لوله تغيير رنگ و توليد گاز و در سه لوله دوم دو لوله و در سه لوله سوم هيچكدام رشد نداشته اند پس طبق جدول تعيين ميزان آلودگي MPN     3-2-o

كه عدد 5/9 مي باشد                                         95 =10 5/9

نتيجه اينكه در هر از نمونه آب 95 نمونه كلي فردي

دیدگاهتان را بنویسید