دانلود فرمت ورد: دانلود گزارشات آزمايشات ميكروبيولوژي محيطي – قسمت دوم

لاكتوفنل كاتن بلو

براي رنگ آميزي لاملها يك قطره رنگ آميزي مخصوص قارچها ( لاكتوز فنل كاتن بلو) كنار دست گذاشته و در كنار شعله پليت را روي سكو قرار مي‌دهيم و گوشه پليت را باز كرده و با پنس يك ضربه كوچك به داخل زده و با همان پنس لامل را برداشته و از سمتي كه ميسليوم به لام چسبيده داخل رنگ مي‌گذاريم و 20 تا 30 ثانيه صبر مي‌كنيم و لام را زير ميكروسكوپ قارچ مورد نظر مطالعه مي‌كنيم. پس از نظاره زير ميكروسكوپ و تطبيق آن با جدول پيوست نظاره گرديد كه مودر شماره 14 Oospora يا Ceotvichum در زير لامل رشد نموده می باشد.

عنوان آزمايش: مرحله تاييدي MPN

هدف: تاييد يا عدم تاييد وجود آلودگي در نمونه، آبي

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را در شماره بندی انتهای صفحه بخوانید              

در اين مرحله از محيط كشت‌هاي اختصاصي از EMB بهره گیری مي‌كنيم كه اختصاصي و هم افتراقي می باشد دليل اختصاصي‌ايي می باشد كه باكتريهاي G+ اجازه رشد نداده و مخصوص G هاست و به اين دليل افتراقي می باشد كه كلونيهاي را تشكيل مي‌دهند تا نسبتاً بزرگ، شل و آبكي و يك مركز تيره رنگ دارند و از همه مهمتر اينكه اگر خود E.Coil باشد تصوير رنگ سبز جلاي فلزي درخشان مي‌باشد در صورتي كه در ساير باكتريها اين گونه نيست.

  • qتعيين Fecal Coliform

روش اقدام: در اين مرحله به تعداد لوله‌هاي مثبت شده لوله آزمايش انتخاب كرده و در آن محيط كشت E.C.Broth داخل آن قرار داده و روي سه لوله اول كه براي سه لوله مثبت شده مورد نظر قرار داده و عدد 10 را ثبت مي‌كنيم و براي دو لوله بعدي كه براي لوله‌هاي مثبت شده سه لوله دوم در نظر گرفته مي‌گردد عدد 1 ثبت مي‌كنيم و در كنار شعله و در شرايط ستورن در كنار شعله با بهره گیری از لوپ به توضیح فوق در لوله‌ها تلقيح مي‌كنيم و در دماي به مدت 24 ساعت در انكوباتور گرماگذاري مي‌كنيم.

طبق نظاره و قرائت نتيجه 3     1   0

در صد ميلي ليتر نمونه هست 10 = 45 ×4.5

عنوان آزمايش: مرحله تكميلي MPN

هدف: نظاره تفكيكي كلي فرمها

در اين مرحله دو تا از لوله‌هاي مثبت شده مرحله قلا مرحله تاييدي را انتخاب كرده و با كمك لوپ روي دو تا محيط كشت يكي كشت مجدد از كلوني‌هايي كه بزرگ بوده و مركز تيره دارند كه اين كشت در لوله حاوي L . B صورت مي‌گيرد و لوله دوم كه در لوله شيب دار N.A از كلونيهاي داراي مشخصات كلي فرمي تلقيح مي‌كنيم پس آنها را به مدت 24 ساعت در درجه حرارت گرما گذاري مي‌كنيم در نظاره اسمير تهيه شده و رنگ آميزي شده از محيط NA با سيلهاي گرم منفي بدون اسپور () تاييد گرديد.

اثر شياكلي داراي مشخصات: لزج، جلاي فلزي، كلوني كوچك مي‌باشد.

در پايان مرحله تكميلي اگر هدف شناسايي باكتري با بهره گیری از محيط شيب دار مورد نظر باشد وارد تستهاي بيوشيميايي مي‌شويم. براي اين تستها بايستي كشت خالص داشته باشيم ( حداقل دو گونه باكتري ) اگر خالص نباشد تستهاي بيوشيمايي با كليد راهنما نمي‌تواند تستهاي بيوشيميايي با روش IMViC انجام مي‌گردد.

عنوان آزمايش: روش صافي غشايي

هدف: تعيين آلودگي آب

در بهره گیری از روش ضافي غشايي از صافي‌هايي بهره گیری مي‌گردد كه قطر منافذ آنها از قطر باكتريها كمتر می باشد وقتي نمونه مورد نظر از صافي بگذرد باكتريها روي ضافي را اگر روي پليت حاوي محيط كشت بگذاريم رشد خواهد كرد.

در اين روش از دستگاه ويژه‌اي بهره گیری مي‌گردد كه شامل سه قسمت مي‌باشد يكي قيف كه فيلتر در درون آن قرار مي‌گيرد دوم پايه نگهدارنده و ارلن خلأ يا تخليه كه با يك شلنگ به پمپ خلأ وصل مي‌گردد كه به غير از پمپ ساير اجزاء بايستي استريل باشد براي اين كار قبلاً با يك تكه آلومينيوم كاغذ فويل آلومينيومي مي‌پوشانيم و همه اجزاء را داخل اتوكلا قرار مي‌دهيم و نزديك شعله پس از استريل كردن بر روي هم سوار مي‌كنيم. البته بهتر می باشد فيلتر را داخل گذاشته و سپس استريل كنيم پوشش روي آن را وقتي بر مي‌داريم كه خواهيم آب را صاف كنيم. اگر آب كدورت بالايي داشته باشند ما مجبور به روشن كردن پمپ مي‌باشيم پس از اين مرحله آب داخل ارلن را جمع مي‌كنيم و در كنار شعله اجزاي دستگاه را جدا مي‌كنيم و پنس را داخل الكل قرار داده و كنار شعله استريل كرده و فيلتر را برداشته و به همان شكل داخل محيط كشت قرار داده و در داخل اتكوباتور به مدت 25 ساعت در دماي گرماگذاري مي‌كنيم براي اين روش معمولاً محيط كشتي را انتخاب مي كنيم كه نيمه جامد بوده و آثار كمتري داشته باشد كه سريعتر جذب فيلتر گردد. اگر باكتريها واقعاً وجود داشته باشند پس از 24 ساعت گرماگذاري روي فيلتر كلي فرمها قابل نظاره و شمارش هستند البته حجم آب بايستي مشخص باشد. روش صافي سريعتر از روش MPN مي‌باشد بدين صورت كه در روش صافي غشايي تا 24 ساعت نتيجه مشخص مي‌گردد در صورتي كه در روش MPN سه تا چهار روز نتيجه طول مي‌كشد. فايده روش ضافي سرعت اقدام آن مي‌باشد و عيب آن اين می باشد كه در مورد آبهاي تصفيه شده راحت مي‌باشد ولي در مورد آب رودخانه كه هم كه مدت و هم تنوع باكتريها بالاست ممكن می باشد سطح فيلتر براي باكتري مناسب باشد و يا نامناسب بوده و پاره مي‌گردد كه البته متداولترين روش براي آبهاي تصفيه شده می باشد.

عنوان آزمايش: تست IMViC

هدف: تشخيص باكتريهاي اشر شياكلي، انتروباكتر و كلبسيلا در آب آلوده نمونه

ويژگيهاي درون سلول يعني توانايي متابوليسمي و آنزيمي سلول زیرا جنسهاي مختلف و گونه‌هاي مختلف واكنشهاي متابوليسمي متفاوتي دارند مثلاً حتي يك جنس واحد يك گونه مي تواند از يك ماده غذايي خاص بهره گیری كند ولي اگر نتواند يك گونه ديگر می باشد.

راه تشخيص: همان اتفاقي كه در درون سلول مي‌افتد با بهره گیری از مواد شيميايي به نوعي قابل نظاره كنيم.

تفاوت آنزيمها را به تستهايي كه تستهاي بيوشيميايي گفته مي‌گردد اندازه‌گيري و مشخص مي‌كنند مثلاً اگر ميكروارگانيسمي اليه توليد كند مي‌توان از راه سنجش PH آن را اندازه‌گيري كرد.

در مورد كلي فرمها يك باكتري مجهول را شناسايي و در اولين كار رنگ آميزي G مي‌كنيم اگر G+ باشد شامل كوكي و با سيل و G شامل كولي و باسيل مي‌باشد باسيل G از خانواده كلي فرمسهاست. يك آزمايش اختصاصي بيوشيميايي G باسيل هست كه به آن آزمون IMViC گفته مي‌گردد كه اختصاصي كلي فرمهاست. چهار تست شيميايي مجموع IMViC را تشكيل مي‌دهند كه براي تشخيص جنس و گونه‌هاي كلي فرمها به كار مي‌رود. اين تست براي شناسايي تمام جنس اين گونه ها و خانواده‌ها كافي نيست اما باكتري كه مورد نظر و جستجوي ماست يكي از سه باكتري 1- اشر شياكلي E-Coli 2- انتروباكتر E.Bacter 3- كلبسيلا مي‌باشد كه هر سه باكتري روده‌اي و از مهمترين كلي فرما هستند. اين تست براي تشخيص اين سه گونه كفايت مي‌كند بخصوص جواب اين آزمون براي جستهاي انتروباكتروكلبسيلا كاملاً يكسان می باشد به همين خاطر بر اساس آزمون IMViC و به خاطر قشا به در يك گروه به نام گروه انتروباكتركلبسيلا ناميده مي‌گردد كه اگر بخواهيم جداسازي بكنيم بايستي سراغ تستهاي ديگري برويم.

روش كار قسمت IMViC :

1) بررسي توانايي بهره گیری ايندول سلول توسط باكتري از اسيد آمينه تريپتوفان بهره گیری مي‌گردد براي اين امر از معرف شيميايي به نام كواكس بهره گیری مي‌كنيم كه اگر اندول وجود داشته باشد تركيب شده و رنگ قرمز رنگ توليد مي‌كند و اگر وجود نداشته باشد تغيير رنگ نداده و زرد رنگ می باشد.

اساس كار به اين صورت می باشد كه در محيط كشت SIM(A) كه نيمه آگار می باشد به صورت عمقي در داخل لوله باكتري مورد نظر را به شكل عمقي با كمك سوزن در امتداد يك خط به شكل عمقي كشت مي‌دهيم و به مدت 24 ساعت در دماي در داخل انكوباتور گرماگذاري مي‌كنيم و پس از آن 10-5 قطره معرف كواكس را روي آن مي‌ريزيم و 15 دقيقه صبر مي‌كنيم اگر مثبت باشد قرمز هاله‌اي تشكيل مي‌گردد و اگر منفي باشه هاله زرد رنگ مي‌باشد. ] پس از انجام نظاره گردید كه قرمز شده می باشد.[

2) آزمون بعدي (M) متيل رد مي‌باشد كه دو تا تست در اين آزمون انجام مي‌دهيم كه با بهره گیری از يك محيط كشت باشد اين محيط كشت مايع MRVP مي‌باشد كه وجود مواد كه بني و قندي در آن كه تعدادي از باكتريها مي‌توانند اين مواد را معرف و مقدار زيادي رسيد توليد كنند و PH محيط را تا 4 – 4.5 پايين بياورند. معرف متيل رد را كه اسيدي می باشد قرمز رنگ مي‌كند كه نشانگر وجود باكتري می باشد. اگر تركيبات كربن دار هم معرف شوند PH = 4.5 و متيل رد قرمز رنگ مي‌گردد ولي اگر كم مصرف گردد PH=6 و متيل رد زرد به رنگ چركي مي‌گردد درجه حراست و به مدت 24 ساعت براي گرماگذاري در اين مرحله لازم می باشد. ] پس از انجام نظاره گردید كه قرمز رنگ شده می باشد [.

3) لوله دوم در آزمون بعدي آزمون تست VP همان باكتري را در همان محيط كشت مي‌دهيم و بعضي باكتريها تمام قند موجود در محيط را نمي‌توانند مصرف كنند و ساير تركيبات را مصرف مي‌كنند و مانند فرآورده‌هايي را كه توليد مي‌كنند استيل متيل كابينول مي‌باشد اين ماده اگر با يك ماده شيميايي به نام باريت تركيب گردد يك رنگ قرمز ايجاد مي‌كند اما اگر در محيط نباشد تقريباً‌ زرد چركي ايجاد مي‌گردد. اساس كار در اين مرحله اضافه كردن معرف پس از گرماگذاري 24 ساعته در درجه حرارت مي‌باشد كه آغاز 10 قطره محلول A و پس از يك الي دو دقيقه هم زدن 10 قطره محلول B را اضافه مي‌كنيم و هم مي‌زنيم تا تركيب گردد سپس 15 دقيقه صبر مي‌كنيم كه اگر رنگ قرمز رنگ گردد VP مثبت می باشد ولي اگر زرد رنگ گردد VP منفي می باشد ] پس از انجام نظاره گردید كه رنگ زرد مي‌باشد.[

4) در مرحله چهارم از محيط كشت خامي به نام سيمون سيترات آگار (SCA) كه سبز رنگ مي‌باشد بهره گیری مي‌گردد كه يك محيط كشت اختصاصي و تنها ماده كربني و انرژي موجود در آن سيترات سديم مي‌باشد. بعضي از باكتريهاي مورد جستجو مي‌توانند سيترات سديم را به عنوان تنها منبع تغذيه‌اي بهره گیری كنند پس رشد مي‌كنند اما اگر باكتري داشته باشيم كه نتواند آن را بهره گیری كند نمي‌تواند رشد كند كه راه تشخيص الف) تشكيل كلوني. ب) توليد تركيبات اسيدي كه رنگ محيط كشت را عوض مي‌كند و اگر رشد كند رنگ محيط را آبي مي‌كنند ولي اگر رشد نكنند رنگ محيط كشت تغييري نكرده و سبز مي‌ماند در اين مرحله كه احتياجي به معرف براي تشخيص نهايي نمي‌باشد به مدت 24 ساعت در دماي گرماگذاري پس از تلقيح لازم می باشد ( معرف موجود در داخل محيط كشت برموتيمول بلو می باشد).

در پايان مراحل IMViC

D       M       VP     C

+       +         –         –

و با در نظر داشتن مثبت بودن I باكتري مورد نظر رشد شياكلي تشخيص داده گردید.

( اگر انتروباكتروكلبسيا باشد

I      M       VP     C

–       –         +       +

عنوان آزمايش: تعيين دانستيه ميكروبي هوا

هدف: تعيين ميازن تراكم باكتريها و قارچها در هواي يك محيط بسته هوا زيستگاه هيچ ميكروارگانيسمي نيست زیرا شرايط زيستي شامل رطوبت ثابت مواد غذايي و عدم تغيير و تحول كافي نمي‌باشد اما مهترين محيط نقل و انتقال ميكروارگانسم‌ها مي‌باشد كه براي تعيين كارآمدي سيستم‌هاي تهويه در محيط‌هاي بسته مثل بيمارستانها بهره گیری مي‌گردد.

محل مورد آزمايش نبايد آقتاب گير بوده و در معرض جريان باد كولر يا بخاري باشد و حداقل نيم متربا با زمين فاصله داشته باشد. با رعايت شرايط فوق مهل روي ميز آزمايشگاه در نظر گرفته گردید و درب پليت‌ها (دوپليت‌ها) را به مدت 30 دقيقه كه يكي حاوي محيط كشت N .A مي‌باشد كه محيط كشت مشترك باكتريها و قارچها مي‌باشد و يكي حاوي محيط كه محيط كشت مشترك باكتريها و قارچها مي‌باشد و يكي حاوي محيط كشت N . A مي‌باشد كه محيط كشت مشترك باكتريها و قارچها مي‌باشد يكي حاوي محيط كشت SDA كه اختصاصي براي قارچها مي‌باشد را باز مي‌گذاريم. به اين دليل بيشتر از 30 دقيقه باقي نمي‌گذاريم كه آب محيط كشت تبخير مي‌گردد. پس از اين مرحله هر دو محيط كشت را به مدت 24 ساعت و در دماي گرماگذاري مي‌كنيم.

براي تعيين باكتريها و قارچها از فرمول‌هاي خاصي بهره گیری مي‌گردد:

تعدادكلوني باكتريها در محيط عمومي   دانستيه تعداد كلونيها
زمان ( برحسب فوت مربع در ساعت (برحسب فوت مربع در دقيقه) تعداد پليت‌ها باكتري
تعدادكلوني قارچها در محيط كشت اختصاصي   دانستيه تعداد كلونيها
تعداد كل كلونيها در محيط عمومي  

شما می توانید مطالب مشابه این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید